SỬ DỤNG KỸ THUẬT POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) KHẢO SÁT THỬ NGHIỆM NGUY CƠ NHIỄM LISTERIA MONOCYTOGENES TRONG MỘT SỐ THỰC PHẨM TRÊN THỊ TRƯỜNG HÀ NỘI

I. ĐẶT VẤN ĐỀ

          Listeria monocytogens có mặt trong thực phẩm là một trong 400 tác nhân gây bệnh từ thực phẩm cho người. Nhiễm L.monocytogenes ở nồng độ 100 CFU có thể gây bệnh listoriosis với một phổ rất rộng các triệu chứng: viêm màng não, nhiễm trùng máu, sẩy thai, và viêm ruột ở người và động vật, đặc biệt nguy hiểm với người bị suy giảm miễn dịch [1,2, 3]. Việc phát hiện sự có mặt của         L.monocytogenes theo phương pháp tiêu chuẩn 52 TCN – TQTP 0002: 2003 gặp nhiều khó khăn do tính phức tạp của phương pháp, và đặc biệt khó thực hiện khi cần phân tích sàng lọc một số lượng lớn mẫu. Nhiều kỹ thuật hiện đại gần đây đã được phát triển và áp dụng để phát hiện nhanh L.monocytogenes với thao tác đon giản hơn, độ chính xác cao và thời gian phân tích ngắn hơn, trong đó, phương pháp dựa trên kỹ thuật PCR là được coi là thích hợp để phân tích sàng lọc mẫu trong phòng thí nghiệm[4, 5, 6,7].

          Phương pháp phân tích L. monocytogenes với cặp mồi LM-F76 và LM-R543 đặc hiệu với gen đích listeriolysin O (hlyA) đã được thiết kế và thử nghiệm đặc hiệu với L. monocytogenes [8] và được phát triển cho từng loại sản phẩm thực phẩm [9, 10, 11], cho phép phân tích một lượng mẫu lớn với độ chính xác cao. Bài báo đề cập kết qủa sử dụng quy trình phân tích dựa trên kỹ thuật PCR áp dụng cho phân tích một số sản phẩm thịt, sữa [10, 11] để bước đầu khaỏ sát mức độ nhiễm  loài vi khuẩn nguy hiểm này trong một số sản phẩm có nguy cơ cao thuộc nhóm này.

II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1.  Mẫu thực phẩm

Mẫu thực phẩm sử dụng trong nghiên cứu bao gồm một số sản phẩm có nguồn gốc từ thịt, sữa được lấy tại các nhà máy hoặc mua tại các cửa hàng thực phẩm và siêu thị trên thành phố Hà Nội trong khoảng thời gian từ 2006 –2008.

2.2.  Môi trường

Môi trường LEB, Difco (Listeria Enrichment Broth) được sử dụng cho tăng sinh vi khuẩn. Môi trường Oxford, Sigma sử dụng để kiểm tra phương pháp. Dung dịch pha loãng mẫu là nước muối sinh lý 0,9% NaCl.

2.3. Hóa chất

Hóa chất cho điện di trên gel agarose, thang ADN chuẩn do Sigma cung cấp. Hóa chất sử dụng cho phản ứng PCR do Amersham Phamacia Biotech cung cấp. Các hóa chất khác có độ tinh sạch phân tích. Cặp mồi LM-F76, LM-R543 [8] và cặp mồi 16S/F rRNA [12] do Invitrogen cung cấp.

2.4. Phương pháp lấy mẫu

Mẫu được lấy ngẫu nhiên theo mẻ sản xuất, theo lô sản phẩm tại cơ sở sản xuất hoặc mua tại cửa hàng, siêu thị. Thời gian lấy mẫu theo mùa: mùa đông (tháng 12-tháng 1) hoặc mùa hè (tháng 4, 5)

Mẫu sữa sử dụng trong nghiên cứu gồm sữa nguyên liệu, sữa thanh trùng, có đóng gói sẵn hoặc bán rời. Mẫu sữa thí nghiệm là các mẫu sữa nguyên liệu hoặc thành phẩm được lấy theo quy trình lấy mẫu tại nhà máy hoặc các mẫu sữa thanh trùng và tiệt trùng có hoặc không có bao gói trên thị trường. Mẫu sản phẩm thịt là sản phẩm chế biến, đã qua xử lý nhiệt hoặc không (xúc xích, nem chua), bán trên thị trường. Các mẫu được lấy, bảo quản đúng quy định và phân tích trong thời hạn sử dụng của nhà sản xuất, mẫu không bao gói được phân tích ngay sau khi lấy mẫu.

2.5. Phương pháp chuẩn bị mẫu

Bao bì mẫu được khử trùng bằng cồn 70^o. Dùng dụng cụ cắt mẫu đã được khử trùng cắt bao bì, cắt và cân trong điều kiện vô trùng 25g mẫu cho một lần phân tích. Mẫu đã lấy được chứa vào túi chuyên dụng chứa 225 ml môi trường LEB đã tiệt trùng để tiến hành đồng hóa mẫu trên thiết bị dập mẫu Stomacher 400.

Phân tích phát hiện L. monocytogenes bằng PCR

Việc phân tích phát hiện sự có mặt của L. monocytogenes trong các mẫu thực phẩm được thực hiện theo các quy trình tương ứng cho các sản phẩm thịt và sữa đã được xây dựng trong các nghiên cứu trước [10, 11]. Các bước thực hiện bao gồm:

- Tăng sinh: 25g mẫu được nghiền (hoặc trộn) trong 225ml môi trường LEB, được đem tăng sinh trong thiết bị lắc ổn nhiệt ở 37^oC tốc độ lắc 200 vòng/phút trong thời gian tương ứng 20-24h.

- Phản ứng PCR và xử lý kết quả: Tiến hành thu nhận DNA từ các mẫu tăng sinh theo phương pháp đã trình bày trong các tài liệu trước [10,11] làm khuôn cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR được thực hiện với thể tích 25ml với chu trình nhiệt gồm 94^oC trong 3 phút, (94^oC 30 giây, 60^oC 30 giây, 72^oC 1 phút) x 35 chu kỳ, 72^oC 5 phút và ổn định sản phẩm ở 10^oC. Kết quả của phản ứng PCR được đánh giá bằng điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5%.

- Phương pháp điện di DNA: 5ml  sản phẩm của phản ứng PCR được kiểm tra bằng phương pháp điện di DNA trên gel agarose 1,5%. Dòng điện sử dụng cho điện di là 100mA. Sau khi điện di, DNA được nhuộm trong dung dịch ethydium bromide và soi dưới bước sóng 254nm.

- Đánh giá kết quả: các mẫu xuất hiện các băng DNA tương ứng với vị trí 468bp trong các phản ứng PCR với cặp mồi LM-F76, LM-R543 là các mẫu bị nhiễm L. monocytogenes.

Phân tích khẳng định kết quả

Các mẫu tăng sinh cho kết quả PCR dương tính được quét trên môi trường Oxoford. DNA từ các khuẩn lạc đen được dùng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi 16S/F. Sản phẩm PCR với cặp mồi 16S/F được tinh sạch với kít tinh sạch DNA do Invitrogen cung cấp. Sản phẩm PCR với đoạn gen 16S rDNA được gửi xác định trình tự và so sánh mức tương đồng với các trình tự 16S rDNA đã công bố trên ngân hàng gen.

III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN

3.1 Các mẫu phân tích

Với khả năng phát triển dễ dàng của L.monocytogenes trong điều kiện khắc nghiệt như môi trường muối, nhiệt độ lạnh, các thực phẩm gia nhiệt không đầy đủ và bảo quản lạnh dài ngày là các thực phẩm có nguy cơ nhiễm L.monocytogenes. Các mẫu thực phẩm được lựa chọn để khảo sát khả năng nhiễm L.monocytogenes trong nghiên cứu này là các thực phẩm có nguồn gốc sữa và thịt, bao gồm 49 sản phẩm thịt (xúc xích, nem chua), 116 mẫu sản phẩm sữa (sữa tươi nguyên liệu, sữa bán thành phẩm, sữa thu hồi trong nhà máy, sữa thanh trùng, tiệt trùng bán trên thị trường) (bảng 1). Các mẫu được phân tích ngay sau khi mua, hoặc bảo quản như điều kiện quy định của sản phẩm. Mọi phân tích mẫu đều được thực hiện trong hạn sử dụng của mẫu.

Bảng 1. Các mẫu sản phẩm dùng cho phân tích

3.2. Kết quả phân tích L. monocytogenes bằng PCR

          Các mẫu được tăng sinh như trình bày trong phần phương pháp.  3 ml  dung dịch DNA được sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR với cặp mồi LM-F76, LM-R543 đặc hiệu cho L. monocytogenes .

Bảng 2. Các mẫu dương tính với LM-F76, LM-R543

Phản ứng PCRvới các mẫu sữa nguyên liệu và sản phẩm cho kết quả âm tính trong khi đó, 15/ 49 phản ứng PCR cho kết quả dương tính với mẫu sản phẩm thịt (bảng 2, hình 1).

          Do ngưỡng phát hiện của phương pháp là 10 CFU/25g, ml sản phẩm [10, 11], như vậy, các sản phẩm sữa phân tích hoặc không nhiễm hoặc nhiễm L.monocytogene dưới mức phân tích,  trong khi đó, các mẫu thịt khảo sát có 11/49 mẫu nhiễm L.monocytogenes ở mức phát hiện của phương pháp.

          Theo các cảnh báo trên thế giới, sữa tươi nguyên liệu và sữa tươi thanh trùng có nguy cơ nhiễm L. monocytogenes cao. Kết quả phân tích cho thấy các mẫu sữa phân tích ngay cả sữa tươi nguyên liệu đều không phát hiện nhiễm L. monocytogenes. Điều này cho thấy điều kiện thu nhận sữa tươi hiện đang được đảm bảo. Sản lượng sữa tươi thấp trong sữa sản phẩm cũng là một đặc điểm ghi nhận trong kết quả phân tích này.

          Ngược lại, các sản phẩm thịt đã lựa chọn để phân tích  đều có mức nhiễm L.monocytogenes khá cao, 11/49 mẫu. 

          Mặc dù mới chỉ là kết quả khảo sát bước đầu khả năng nhiễm vi khuẩn này trong thực phẩm nhưng kết quả phân tích cũng cho thấy rõ, các sản phẩm không được gia nhiệt đầy đủ và được bảo quản lạnh dài ngày là các thực phẩm thực sự có nguy cơ nhiễm L.monocytogenes. Tuy vậy, do số lượng mẫu được khaỏ sát chưa nhiều, các số liệu công bố ở đây chỉ có tác dụng cảnh báo tình trạng một số thực phẩm trên thị trường nhiễm loại vi khuẩn nguy hiểm này cần phải được kiểm soát.

3.2. Khẳng định kết quả phân tích

Phương pháp PCR sử dụng trong phân tích này đã được kiểm nghiệm với phương pháp tiêu chuẩn và được cấp giấy xác nhận tính tương đồng của phương pháp tiêu chuẩn [13].

Hình 2. Chủng BK7 phân lập từ mẫu C12  phân tích trên môi trường Oxford 48h (a) và nhuộm Gram (b)

          Ở đây, chúng tôi tiến hành khẳng định lại các chủng L.monocytogenes phân lập từ các mẫu tăng sinh cho phản ứng dương tính với phân tích PCR bằng kiểm tra khuẩn lạc và bằng kỹ thuật 16S rDNA.  Các dịch tăng sinh dương tính được quét lên môi trường thạch Oxford, nuôi ở 37⁰C trong 48h. Trên môi trường thạch Oxford, toàn bộ các mẫu tăng sinh dương tính tạo thành các khuẩn lạc mầu đen hoặc xanh đen đặc trưng (hình 2a). Các chủng phân lập được trên môi trường Oxford được nhuộm Gram. Kết quả nhuộm cho thấy đây là vi khuẩn Gram dương, không hình thành capsul, không sinh bào tử (hình 2b).

Bảng 4. So sánh trình tự chủng BK7 thu

từ mẫu C12

          DNA thu được từ các khuẩn lạc tách từ môi trường Oxford của các dịch tăng sinh dương tính được dùng làm khuôn cho phản ứng nhân đoạn gen 16S rDNA với cặp mồi 16S/F. Sản phẩm PCR với đoạn mồi này được tinh sạch, xác định trình tự, so sánh với trình tự hlyA của L. monocytogenes  trên ngân hàng gen,  cho thấy gen hly A của chủng nghiên cứu tương đồng với các trình tự 16S rDNA của L. monocytogenes  khác đã được công bố (bảng 3, 4). Kết quả này chứng minh các khuẩn lạc đen trên môi trường Oxford thu được từ các dịch tăng sinh dương tính với đọan gen hlyA chính là L. monocytogenes. Vì thế mức độ nhiễm L. monocytogenes trong các sản phẩm thịt phân tích được xác nhận là 11/49 mẫu phân tích. 

IV. KẾT LUẬN

          Kết quả khảo sát bước đầu các mẫu sản phẩm thịt có trên thị trường cho thấy sự nhiễm L. monocytogenes ở mức cần phải được quan tâm. Hiện nay, L. monocytogenes chưa được quan tâm nhiều trong các vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm, nhưng nguy cơ nhiễm loại vi khuẩn này trong các thực phẩm, đặc biệt là các thực phẩm ăn liền như trong phân tích này là có thật. Đây là công bố đầu tiên về mức nhiễm loại vi khuẩn này trong thực phẩm trên thị trường Hà nội. Cần thiết có các khaỏ sát trên diện rộng hơn về mức độ nhiễm L.monocytogenes trên thực phẩm hiện nay để có các giải pháp cần thiết bảo vệ sức khỏe cộng đồng.

Nghiên cứu này được thực hiện dưới sự tài trợ của đề tài AP05\Prj3\Nr01.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1.      Posfay-Barbe K. M. Listeriosis. Pediatrics in Review. 2004; 25:151-159.

2.      Herman L. M. F., Block J. H. G. E. d. and Moermans R. J. B. Direct detection of Listeria monocytogenes in 25 milliliters of raw milk by a two-step PCR with nested primers. App. Environ. Microbiol. 1995; 61:817-819.

3.      Rodríguez-Lazaro D., Hernandez M., Scortti M., Esteve T., Vazquez-Boland J. A. and Pla M. Quantitative detection of Listeria monocytogenes and Listeria innocua by real-time PCR: Assessment of hly, iap, and lin02483 targets and amplifluor technology. App. Environ. Microbiol. 2004; 70:1366-1377.

4.      Sachse K. and Frey J. 2003. PCR detection of microbial pathogens: methods and protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc. 347 pp.

5.      Kawasaki S., Horikoshi N., Okada Y., Takeshita K., Sameshima T. and Kawamoto S. Multiplex PCR for simultaneous detection of Salmonella spp., Listeria monocytogenes, and Escherichia coli O157:H7 in meat samples. J. Food Prot. 2005; 68:551-556.

6.      Wu S.-J. and Kado C. I. Preparation of milk samples for PCR analysis using a rapid filtration technique. J. App. Microbiol. 2004; 96:1342-1346.

7.      Makino S.-I., Okada Y. and Maruyama T. A new method for direct detection of Listeria monocytogenes from foods by PCR.. App. Eviron. Microbiol. 1995; 61:3745-3747.

8.      Nguyễn Kim Hoa. 2004. Phát triển kỹ thuật PCR trong phân tích vi sinh vật gây bệnh thực phẩm. Luận văn Thạc sỹ, Đại học Bách khoa Hà nội.

9.      Sachse K. and Frey J. 2003. PCR detection of microbial pathogens: methods and protocols. Totowa, New Jersey: Humana Press Inc. 347 pp.

10.  Xuan-Hung Nguyen, Xuan Sam Nguyen, Kim-Anh To, (2005). Simple DNA extraction for polymerase chain reaction (PCR) detection of pathogen Listeria monocytogenes in milk products, Proceeding of 12^th regional symposium on Chemical Engineering, Hanoi, 1, 213-218, Nov. 2005.

11.  Nguyễn Minh Thực, 2006. Xây dựng quy trình phân tích nhanh vi khuẩn Listeria monocytogenes trên sản phẩm thịt chế biến. ứng dụng quy trình phân tích khảo sát mức độ nhiễm L. monocytogenes trên một số thực phẩm nguy cơ.  Luận văn tốt nghiệp, Đại học Bách khoa Hà nội.

12.  Trần Ngọc Hân, 2004. Các thông số ảnh hưởng đến hệ thống xử lý kết hợp các hợp chât nitơ và cấu trúc hệ vi sinh vật trong hệ thống. Luận văn Thạc sỹ, Đại học Bách khoa Hà nội.

13.  Tô Kim Anh et al, 2007. Development and validation of DNA-based kits for rapid detection of pathogen bacteria Listeria monocytogenes and Bacillus cereus applied in food safety control. Project final evaluation report. Hanoi University of Technology.

Nguyễn Minh Thực, Trần Mạnh Hùng, Trịnh Thu Lê, Tô Kim Anh

Viện Công nghệ sinh học-Công nghệ thực phẩm, Đại học Bách khoa Hà nội

(Trích kỷ yếu Hội nghị toàn quốc an toàn vệ sinh thực phẩm năm 2009)